خصوصا اونایی که فکر میکنن PCR  آزمایش راحتیه …

——

Routine PCR? Let’s be honest, there’s no such thing. Even with the simplest PCR reaction things can go wrong, so you need to have a good checklist of ideas for troubleshooting and rectifying the problem. Today I have brainstormed all of the ways I can think of to approach problems with standard PCR reactions.

I’ve inevitably missed some things out so please chip in if you can think of anything else to add. I will add your ideas to the list to make it a resource we can all refer to.

No amplification

1. Try the reaction again, you may have missed something out.

2. Check that the polymerase buffer has been fully thawed and mixed thoroughly.

3. Check that the primers have been diluted to the correct concentration.

4. Make up a new dNTP solution. dNTPs can be destroyed by repeated freeze-thaw cycles

5. Re-make the template DNA, especially if you are working with genomic DNA. Old stocks may be degraded or sheared.

6. Use a different polymerase. If an amplification is problematic with a proofreading polymerase, I often try using good old Taq and this often solves the problem. Remember to sequence the insert though – if you are lucky there won’t be any significant mutations and you can use the insert as it is. Otherwise, re-do the PCR with a mixture of Taq and 1/10th concentration of your proof-reading enzyme and you should still get the same amplification with a lower error rate.

7. Change the annealling temperature. If the annealling temperature is too high, you obviously won’t get any priming at your desired sequence. On the other hand, an annealing temperature that is too low can result in such non-specific priming that no specific bands arise. The best way to find the optimum temperature is to use a gradient cycler and test a range from the lowest primer Tm to 10 degC below in 1 degC increments.

8. Try reactions with varying template concentrations. Your template concentration may be too low or the concentration of impurities in your prep may be too high. Try 5-10 parallel reactions with concentrations from 10 to 200 ng in a 50 microlitre reaction.

9. Check the cycler – are the temperatures and times as you expect?

10. Try the reaction in another cycler – the calibration of the one you are using may be off.

11. Try an additive. I find that DMSO is especially useful in problematic amplifications.

12. Redesign the primers – try to stick to the guidelines as closely as possible.

Non-specific band amplification

13. Re-do the reaction with a negative control (no template). The non-specific bands could be from contamination of one of your stocks with foreign DNA (probably yours!). If this is a problem, use new stocks, always use autoclaved PCR vials and wear gloves and a lab coat.

14. Increase the annealling temperature. Better yet, use a gradient PCR machine (see 7.)

15. Redesign the primers and make the 3′ longer. The extra bands may be from similar sequences to your target. Increasing the primer length will make them more specific for your target.

16. Increase annealling time if the non-specific products are shorter than your target. If they are longer than you target, reduce the annealling time.

17. Use less DNA template

18. Try touch-down PCR

Weak amplification of your target

19. Reduce the annealling temperature

20. Increase the annealling time

21. Increase primer, template and/or polymerase concentrations

22. Try touch-down PCR

23. Increase the number of cycles

24. Try an additive.

25. Clean up the isolated target and use it as the template in a new reaction.

…now, what have I missed out?

الان دو تا کامنت هست …

یعنی فقظ دو نفر قراره این مطالب رو بخونن ؟

ولی خوب .. امرور عصر مینویسم مطلب جدید رو

آخه لپتاپم کی بورد فارسی نداره و سخته برام که  زیاد بنویسم.

اول از همه .. rozha جان .. ممنون از لطفت

بله- من همکلاسی عباس ام و توی آزمایشگاه داریم کنار هم کار میکنیم . البته تو دوتا آزمایشگاه متفاوت کار میکنیم چون عباس داره روی سلولهای یوکاریوت کار میکنه و من روی مخمر

———

در مورد اینکه چی میخوام بنویسم.

میخوام هر روز مراحل کاری خودم تو آزمایشگاه رو مختصر توضیح بدم.

کار من بیان یک ژن در مخمر ساکارومایسز سرویزیه است و مطالعه اثرات این بیان

-

واسه بیان یک ژن خارجی به سلول مخمر که  هدف مرحله اول پروژه من هست باید اول اون ژن رو به کمک PCR تکثیر کنید، در حین PCR محل های برش آنزیم های برش دهنده را به ژن اضافه کنید،قطعه حاصل از PCR را با دو آنزیم برش دهنده برش بدید، بعد از برش دادن یک وکتور رو با آنزیم های مشابه برش داده و  ژن را به کمک آنزیم لیگاز در وکتور برش داده شده وارد کرده و حلقه کامل رو ایجاد کنید.

بعد از این کار وکتور رو وارد باکتری کرده، اونجا تکثیرش میکنیم، بعد از اون از باکتری خارج کرده و وارد مخمر میکنیم .

-

چه کار ساده ای …

پس توی وبلاگ من از امروز این مبحث رو به صورت کامل توضیح میدم تا بتونه راهنمای کار توی این زمینه باشه

.

.

.

اگه بدونید چه حسی شدم دیدم این همه کامنت نخونده دارم …

و یه وبلاگ گرد و خاک گرفته …

و یه بازی مسخره به اسم تراوین که همه زندگیمو فلج کرده  …

میخوام بازم بنویسم …

همین روزها شروع میکنم باز …

ممنون از کامنت هاتون و شرمنده از بی جواب موندنشون …

اینبار نمیگم از امروز خوب مینویسم …

شاید این وبلاگ رو از فرم وبلاگ در آوردم و به شکل یک سایت شخصی درش بیارم

که فقط امکان ارتباط و گرفتن فایل  روی سایت باشه

–

ولی در هر صورت

این چند وقته با وجود مشغله کاری بالا ، به یه بازی جالبی برخورد کردم که واقعا از نظر من ارز بازی کردن رو داره

تراوین رو حتما دیدید و اسمش رو شنیدید

این بازی یک سرزمین مجازیه که شما توی اون میتونید زندگی کنید، تجارت کنید  و متحدانی داشته باشید

بازی شبیه تمام بازی های استراتژیک ای یه که برای کامپیوتر ساخته شده اند، با این تفاوت که زمان بازی بین ۱ تا دو ساله و نیازی نیست شما همیشه پای بازی باشد

به عنوان یک سرپرست میتونید روزی ۲ یا ۳ بار به سرزمینتون نگاهی کنید و استراتژی های اون رو پیاده کنید

دیگه مطلب اضافه ای برای گفتن ندارم ، چون در ابتدای بازی یک راهنما با شما مرحله به مرحله بازی رو میاد و قسمت ها رو معرفی میکنه تا زمانی که اطلاعاتتون از بازی کامل بشه

برای راهنمایی گرفتن روی عکس آدمی که در گوشه سمت راست صفحه ایستاده کلیک کنید و …

در صورتی سوالی در مورد نحوه انجام بازی داشتید در قسمت کانت ها سوالتون رو بپرسید

این هم لینک بازی :

www.travian.ir/

—

Yeast Cell Wall

IMMUNOWALL is a prebiotic composed by polysaccharides of immune stimulating action, derived from the Saccharomyces cerevisiae yeast cell wall. Polysaccharides (80-90% of the cell wall) of IMMUNOWALL are constituted of glucans, mannans (mannose polymers), quitines (glucosamine polymers), and galactans (galactose polymers). Other compounds, such as fucose, rhamnose, xylose, and uronic acids, are also present in smaller amounts. Glucans refer to a large group of d-glucose polymers with glycosidic bridges and 1,3 and 1,6 bonds. IMMUNOWALL also has proteins, lipids and phosphate in its composition.

GENERAL IMMUNOWALL BENEFITS:

- IMMUNOWALL is 100% natural prebiotic, without residues;

- IMMUNOWALL prevents colonization of the intestinal tract by pathogens;

- IMMUNOWALL stimulates the immune activity of the phagocytic cells (macrophages, neutrophils, lysozyme and interferon);

- IMMUNOWALL increases in 25% secretion of IgA, antigens of the intestinal tract that prevent the adherence of pathogenous bacteria to the cells of the intestinal epithelium;

- IMMUNOWALL enhances the action of beneficial bacteria such as Lactobacillus and Bifidobacteria;

- IMMUNOWALL acts as an adsorbent of mycotoxins.

دسته اول
آنانی که وقتی هستند هستند ، وقتی که نیستند هم نیستند
عمده آدم‌ها حضورشان مبتنی به فیزیک است. تنها با لمس ابعاد جسمانی آن‌هاست که قابل فهم می‌شوند. بنابراین اینان تنها هویت جسمی دارند.
.
دسته دوم
آنانی که وقتی هستند نیستند ، وقتی که نیستند هم نیستند
مردگانی متحرک در جهان. خود فروختگانی که هویت شان را به ازای چیزی فانی واگذاشته‌اند. بی‌شخصیت‌اند و بی‌اعتبار. هرگز به چشم نمی‌آیند. مرده و زنده‌شان یکی است.
.
دسته سوم
آنانی که وقتی هستند هستند ، وقتی که نیستند هم هستند
آدم‌های معتبر و با شخصیت. کسانی که در بودنشان سرشار از حضورند و در نبودنشان هم تاثیرشان را می‌گذارند. کسانی که همواره به خاطر ما می‌مانند. دوستشان داریم و برایشان ارزش و احترام قائلیم.
.
دسته چهارم
آنانی که وقتی هستند نیستند ، وقتی که نیستند هستند
شگفت‌انگیزترین آدم‌ها در زمان بودشان چنان قدرتمند و با شکوه‌اند که ما نمی‌توانیم حضورشان را دریابیم، اما وقتی که از پیش ما می‌روند نرم نرم آهسته آهسته درک می‌کنیم. باز می‌شناسیم. می‌فهمیم که آنان چه بودند. چه می‌گفتند و چه می‌خواستند. ما همیشه عاشق این آدم‌ها هستیم. هزار حرف داریم برایشان. اما وقتی در برابرشان قرار می‌گیریم قفل بر زبانمان می‌زنند. اختیار از ما سلب می‌شود. سکوت می‌کنیم و غرقه در حضور آنان مست می‌شویم و درست در زمانی که می‌روند یادمان می‌آید که چه حرف‌ها داشتیم و نگفتیم. شاید تعداد این‌ها در زندگی هر کدام از ما به تعداد انگشتان دست هم نرسد.

—

من دانشچوی ارشد میکروبیولوژی هستم
دنبال مطلب در مورد تاثیر استرس ph روی میکروارگانیسمها میگردم
مقالاتی داری یا میتونی کمکم کنی چطوری پیداشون کنم
سایت امازون اجازه نمیده کتاب فیزیولوژی میکروارگانیزمهای موئات رو ببینم

—————————————————————————————-

دوست عزیز این کتاب به فیزیولوژی فوستر معروفه و اینم لینک دانلودش http://rapidshare.com/files/43173153/micphy.rar …

آمازون سایت فروش کتابه و به هیچ وجه به شما کتاب رایگان نمیده .

در مورد استرس Ph قطعا شما از من بیشتر میدونید چون شما یک میکروبیولوژیست هستید و من بیوتکنولوژیست ….

Okay, yes, it’s a mistake. I know it’s a mistake.

But there are certain things in life where you know it’s a mistake

but you don’t really know it’s a mistake

because the only way to really know it’s a mistake is to make the mistake,

and look back, and say, “Yep. That was a mistake.”

So, really, the bigger mistake would be to not make the mistake,

because then you go your whole life not really knowing if something is a mistake or not.

And, damn it, I’ve made no mistakes!

I’ve done all of this– my life, my relationship, my career– mistake-free.

————

دیروز یکی از دوستان توی کامنت خودشون ازم خواستن در مورد بیوتکنولوژی و گرایش های اون توضیح کامل بدم

من در اولین فرصت یه مطلب کامل در این مورد می نویسم

پس نوشته بعدی من میشه در مورد گرایش های بیوتکنولوژی …..